PCR Test Überblick für Ärzte

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Unser wichtigster Helfer im Kampf gegen Covid-19?


Lesedauer: 12 min.

In diesem Beitrag gibt die Molekular-Medizinerin Carla Schmidt der Oxford University einen Überblick zum PCR-Testverfahren. Sie geht unter anderem auf die häufigsten Fragen, die Relevanz des Testverfahrens während der Covid-19-Krise sowie Fehlerquellen bei der Auswertung ein und beantwortet die Frage, was Ärzte bei der Probenahme für den Test unbedingt beachten müssen.

 

Was ist eine PCR oder ein PCR-Test?

In den letzten 40 Jahren hat die PCR Karriere gemacht – in der Forschung ist sie nicht wegzudenken und wird für eine Vielzahl von Experimenten und Analysen genutzt. Das wichtigste Anwendungsgebiet für den Alltag ist wohl das Erstellen von genetischen Fingerabdrücken.

Mithilfe der PCR können DNA-Fragmente vervielfältigt, ‚sortiert’ und analysiert werden. Dabei kann jedem Menschen ein einzigartiges Muster zugeordnet werden, was schon einige Serienmörder den Job gekostet hat. Im Frühjahr 2020 erreicht die Relevanz der PCR nun einen neuen Höhepunkt.

Der Begriff ‚PCR’ stammt aus dem Englischen und ist eine Abkürzung für ‚polymerase chain reaction’ (deutsch: Polymerase-Kettenreaktion). Die PCR ist heutzutage die gängigste Methode, um Erbsubstanz, also DNA-Fragmente, im Labor zu vervielfältigen. Der Vorgang ist dabei analog zu dem der DNA-Verdopplung in einer lebenden Zelle. Einem jeden PCR-Test liegt also das Prinzip der exponentiellen DNA-Vervielfältigung zugrunde.

Das PCR-basierte Testverfahren ist in der Covid-19-Pandemie der Goldstandard, um Sars-CoV-2 in Patienten-Proben nachzuweisen. Wie genau und weshalb möchte ich im Folgenden genauer erklären.

 

Wer hat die PCR erfunden?

Als Erfinder der PCR wird normalerweise der Amerikaner Kary Mullis genannt. In den 80ern hatte er die Idee ein Verfahren zu Entwickeln mit dem man DNA durch wiederholte Verdopplung in mehreren Zyklen künstlich vervielfältigt. 1993 bekam er hierfür den Nobelpreis für Chemie. Wie so oft in der Welt der Wissenschaft hatte der norwegische Wissenschaftler Kjell Kleppe allerdings schon in den 70ern die Idee DNA durch zwei flankierende Primer zu vervielfältigen. Seine Idee geriet jedoch schnell in Vergessenheit.

 


Wie funktioniert die PCR?

Eine PCR wird aus zwei Gründen durchgeführt:

(A) Um Erbgut-Material (also DNA oder RNA) zu vervielfältigen (amplifizieren)

(B) Um die vervielfältigten Produkte zu untersuchen und identifizieren

Ganz einfach gesagt: Die PCR gibt Aufschluss darüber, was für DNA, und somit was für ‚Lebewesen’, Erreger oder Ähnliches sich in der untersuchten Probe befinden. Grundsätzlich wird eine PCR in drei Schritten durchgeführt.

Schritt 1:
Der wichtigste Bestandteil dabei ist das Enzym DNA-Polymerase.
Im ersten Schritt werden die doppelsträngigen DNA Fragmente bei einer hohen Temperatur (95°C) denaturiert, also aufgeschmolzen, und so in zwei Einzelstränge getrennt.

Schritt 2:
Während des zweiten Schrittes (bei ca. 60°C) werden zwei synthetisch hergestellte Oligonukleotide (oder auch einzelsträngige DNA-Fragmente) bekannter Sequenz genutzt, welche an jeweils einen der beiden DNA-Einzelstränge anbinden. Diese Fragmente, oder auch Primer, werden so designet, dass sie genau auf den DNA-Abschnitt, welcher vervielfacht werden soll, passen. Man kann sich die Primer als Startrampe und die DNA-Polymerase als die Rakete vorstellen. Sobald die Primer an die Einzelstränge binden kann die DNA-Polymerase wiederum an die Primer ‚andocken’ und mit der Arbeit beginnen.

Schritt 3:
Dies passiert im dritten Schritt (Elongation) der PCR (bei ca. 70 °C) wobei die DNA-Polymerase den passenden Komplementär-Strang, also das passende Gegenstück zu den aufgeschmolzenen DNA-Einzelsträngen, synthetisiert. Aus einem DNA-Fragment entstehen dadurch zwei neue, identische DNA-Fragmente und aus diesen entstehen vier neue. Die PCR ist also ein
exponentieller Vorgang und wird daher Kettenreaktion genannt.

Ein PCR-basierter Nachweis für Viren kann entweder negativ oder positiv ausfallen. Wenn Virus-Erbgut in der Probe präsent ist, dann binden die designten Primer und die Polymerase vervielfältigt die DNA, der Test fällt positiv aus.

Wenn kein Virus in der Probe ist, dann ist das Testergebnis negativ und man misst genau so viel Erbgut wie ursprünglich vorhanden (es hat keine Vervielfältigung stattgefunden).

Thermocycler für das PCR

Bild: Thermocycler für das PCR. Urheber: GFJ / CC BY-SA (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0)

 

Wie lange dauert eine PCR?

Der aus drei Schritten (Denaturation, Annealing, Elongation) bestehende Vorgang wird ca. 30-40 mal wiederholt. Die Gesamtreaktion dauert dabei etwa 1-2 Stunden. Die Dauer einer PCR hängt davon ab wie lang die zu vervielfältigenden DNA-Fragmente sind.

Wie lange ein PCR-basierter Test für Sars-CoV-2 dauert, hängt von mehreren Faktoren ab. Dazu gehört vor allem, welches Equipment im jeweiligen Labor vorhanden ist. Ein Beispiel: Die Maschine in der die PCR stattfindet, also den Thermocycler, gibt es mit verschiedenen Leistungsstufen. Außerdem spielt die Qualität der Probe eine Rolle und was für Materialien dem Labor zur Verfügung stehen. Im Durchschnitt kann man für einen PCR-basierten Sars-CoV-2 Test mit ca. 4-5 Stunden Laborzeit rechnen.

 

Wie funktioniert die PCR?

Im Grunde könnte man eine PCR auch daheim durchführen. Heutzutage braucht man nicht viel mehr als ein PCR-Kit, welches man online bei verschiedenen Firmen bestellen kann und einen PCR-Block oder auch Thermocycler in dem die verschiedenen Temperaturen und Zeitrahmen für die drei Schritte eingestellt werden können.

In den PCR-Kits sind alle Lösungen und Reagenzien vorbereitet, man braucht lediglich die zu untersuchende Probe und kann dann den Schritten in der ‚Gebrauchsanleitung’ folgen. Etwas mehr im Detail: das Rezept für die PCR ist einfach. Man benötigt nur vier ‚Zutaten’. Die DNA, die vervielfältigt werden soll (quasi aus der entnommenen Probe), die passenden Primer (werden im Vorfeld entweder selbst designet oder können bestellt werden), die DNA-Polymerase und einzelne Erbmaterial-Bausteine, auch Nukleotide genannt.

Die Nukleotide kann man sich wie Legosteine vorstellen, welche von der DNA-Polymerase genutzt werden, um an die DNA ‚anzubauen’. Die DNA-Polymerase sowie die Nukleotide können als Mix bei Firmen bestellt werden.

PCR-Test-Kit zur Feststellung von Covid-19

Bild: PCR-Test-Kit zur Feststellung von Covid-19.

 

Der PCR-basierte Test für Sars-CoV-2

Gerade bei einer neuen und unbekannten Pandemie ist es sehr wichtig, dass man einen Überblick bekommt, wie viele Leute tatsächlich infiziert sind. Es ist gut zu Wissen, dass die PCR uns hierbei entgegenkommt, denn sie ist äußerst zuverlässig, sensitiv und spezifisch.

Das Team um Christian Drosten an der Berliner Charité hat Primer designt, welche an Regionen des für alle Coronaviren typischen E-Gens sowie RdRp, den Code für ein Enzym, das das Viruserbgut vervielfältigt, binden. Wichtig ist, dass die Primer dabei so designt wurden, dass sie spezifisch für Sars-CoV-2 sind.

Der Test spricht somit zwar auf das gesuchte Virus an, nicht aber auf die ihm verwandten Viren wie Sars oder die humanen Coronaviren.

Um, wie im Falle von Sars-Cov-2, Viren gezielt nachzuweisen, wird eine spezielle Form der PCR genutzt. Die quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR). Bei der quantitativen PCR wird der Reaktion ein inaktiver Fluoreszenzfarbstoff beigemischt, häufig SYBR Green. Der Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green lagert sich in DNA-Doppelstränge ein und bei jedem Zyklus kann die Fluoreszenz gemessen werden, woraus man auf die Menge der amplifizierten DNA schließen kann. Durch die Verwendung von Standardkurven erlaubt diese Technik eine absolute Quantifizierung (also Kopieanzahl) pro Reaktion.

Das bedeutet, dass genau bestimmt werden kann, wie viel Virus-Erbmaterial sich in der Probe des Patienten befindet. Wie bei vielen anderen Viren besteht das Erbmaterial von Sars-CoV-2 nicht aus DNA, sondern aus einem einzelnen Strang, sogenannte RNA.

Um RNA mithilfe einer PCR zu vervielfältigen, muss sie erst in DNA umgeschrieben werden. Die PCR funktioniert nämlich nur mit einem doppelsträngigen Ausgangsprodukt. Dabei kommt ein weiteres Enzym, die Reverse Transkriptase (RT), zum Einsatz, welche die Sars-CoV-2 RNA in DNA umwandelt. Danach kann die klassische PCR durchgeführt werden.

Die folgende Abbildung zeigt die klassische PCR auf der linken und den PCR-basierten Nachweis für Sars-CoV-2 auf der rechten Seite.

Gegenüberstellung eines herkömmlichen PCR-Tests (links) und eines Covid-Tests (rechts)

Grafik: Herkömmlicher PCR-Test (links) | Covid-Test (rechts)

Das alles hört sich komplizierter an, als es ist. Für die meisten Labore in Deutschland gehört der PCR-Test zum Alltag. Das spiegelt sich auch in den Zahlen wider. Derzeit werden in Deutschland täglich ca. 35.000 PCR-basierte Tests zum Nachweis von Sars-CoV-2 durchgeführt.

Zum Vergleich: in England sind es derzeit ca. 10.000 Tests täglich. Allgemein stellt sich häufig die Frage, warum einige Länder mehr testen und andere weniger.

Was limitiert die Anzahl der PCR-Tests, die während der Corona-Pandemie durchgeführt werden?

In den Medien wird hier häufig der wirtschaftliche Aspekt aufgegriffen: Die Ressourcen sind knapp. Zu den Ressourcen zählen hierbei die Reagenzien, um die Tests durchzuführen sowie das wissenschaftliche Personal.

Der PCR-Prozess an sich ist fast voll automatisiert und wie bereits erwähnt Standard in den meisten deutschen Laboren. Das Problem sind eher mangelnde Vorräte an Test-Kits und PCR-Tests. Im ersten Teil des Blogs habe ich bereits erwähnt, welche ‚Zutaten’ man für einen PCR-Test benötigt. Man muss jedoch verstehen, dass hinter der Entwicklung und der Verbesserung bis hin zum optimalen PCR-Test viele Jahre Forschung stecken.

Man kann sich das wie bei einem Kuchenrezept vorstellen: obwohl man die Zutaten kennt, muss man herausfinden, wie viel von welcher Zutat man benötigt, in welcher Reihenfolge man sie zusammenmischt und für wie lange der Teig in den Ofen kommt.

Auf den PCR-Test bezogen bedeutet das, dass man zum einen die einzelnen ‚Zutaten’, also die passenden Primer, die DNA-Polymerase und einzelne Nukleotide, kennen muss und selbst mischen kann. Das ist aber mit deutlich mehr Arbeit und Zeitaufwand verknüpft als die Alternative: Pharmafirmen stellen PCR-Kits her, bei denen alle Lösungen fertig gemischt sind, quasi die fertige ‚Backmischung’ für den Kuchen.

Ein solches Test-Kit kostet ca. 550 Euro für 50 Tests. Dieser stolze Preis erklärt auch, weswegen man für einen freiwilligen Sars-CoV-2 Test einen Selbstkostenanteil von ca. 100 Euro trägt. Im Allgemeinen ist es wichtig zu verstehen, dass man für jeden PCR-basierter Test, egal ob vorgefertigtes Kit oder selbst vorbereitet, verschiedene Reagenzien benötigt, welche wie alle anderen Ressourcen einfach knapp werden können.

Es geht also nicht wirklich darum, wie viel die Regierung ins Testen investiert, sondern auch, wie viele Test-Materialen letztendlich verfügbar und vor allem für die Labore zugänglich sind. Eine PCR funktioniert nur dann, wenn alle Bestandteile im jeweiligen Labor vorhanden sind. Dabei stößt das System auf Probleme, die gerade in allen Lebenslagen präsent sind. Viele Firmen die PCR-Reagenzien herstellen oder verkaufen befinden sich im Ausland. Und obwohl die Post in Deutschland noch liefert, und die Grundversorgung gewährleistet ist, kommt es bei internationalen Lieferungen zu Verspätungen und Ausfällen.

Testen ist wichtig, um vor allem die hohe Dunkelziffer an Sars-CoV-2 Infizierten zu identifizieren und das weiß jede Regierung. Wenn man jedoch nicht die richtigen Zutaten hat, kann man auch nicht richtig testen.

Video: Dunkelziffer der Coronafälle. BR24.

Was kann beim PCR-Test schiefgehen?

Fehler bei der Auswertung

Wenn der Test positiv ausfällt, kann man jedoch mit höchster Wahrscheinlichkeit, und dabei spreche ich von mehr als 99 Prozent, davon ausgehen, dass diese Person infiziert ist.

Wenn der PCR-Test so spezifisch und effektiv ist, wieso wurde Frau Merkel dann insgesamt drei mal getestet, obwohl alle Tests negativ waren?

Das liegt eher am potenziellen menschlichen Versagen, als an der Fehlerhaftigkeit des Tests selbst. Fehler passieren – das ist menschlich. Vor allem in einer Ausnahmesituation wie sie gerade herrscht. Der Sars-CoV-2-Nachweis ist ein längerer, über mehrere Tage gestreckter Prozess von der Probenentnahme bis hin zum Testergebnis und involviert mehrere Personen wie zum Beispiel Ärzte/Ärztinnen und Labortechniker*innen. Dabei kann es natürlich auch zu Fehlern kommen.

Nach jahrelanger Laborerfahrung weiß ich, wie leicht aus Versehen eine falsche Substanz pipettiert oder der Thermocycler falsch einstellt wird. Bei schlechter Test-Qualität geht man meistens davon aus, dass Fehler im Labor passiert sind. Deswegen wird der Test auch mehrmals wiederholt, wenn konkreter Verdacht auf eine Sars-CoV-2-Infektion besteht.

 

Was Ärzte wissen müssen: Fehler, die durch falsche Probeentnahme entstehen

Jedes Labor kann nur mit dem arbeiten, was es von den Ärzten und Kliniken bekommt. Das bedeutet, die Qualität des Abstriches beeinflusst den Testprozess massiv. Es ist bekannt, dass Sars-CoV-2 während einer Infektion im Rachen und Nasenraum am meisten verbreitet ist.

Deswegen werden für den PCR-Test Abstriche gemacht, meist von Mund und Nase. Wie viel Virus tatsächlich vorhanden ist und wo genau sich die Viren befinden ist von Mensch zu Mensch unterschiedlich. Die WHO und das Robert Koch-Institut geben wichtige Richtlinien für die Probeentnahme, die dem PCR-Test vorausgeht. Dazu gehört vor allem, dass Proben parallel aus den oberen und den tiefen Atemwegen entnommen werden. Bei tiefen Atemwegsinfektionen ist die alleinige Testung von Probenmaterial aus dem Oro- und Nasopharynx zum Ausschluss einer Infektion nämlich nicht geeignet, da in dieser Phase der Erkrankung ggf. nur Material aus dem unteren Respirationstrakt oder Stuhl in der PCR positiv sind. Mehr hierzu auf der Seite des RKI.

Video: Anleitung eines korrekten Nasopharyngealabstrichs. Universitätsklinikum Leipzig.

Geschwindigkeit als wichtigster Faktor

Außerdem muss jeder Abstrich gründlich durchgeführt werden, um gegebenenfalls so viel Virus-Erbgut wie möglich ‚einzufangen’. Obwohl die PCR bereits bei sehr geringen Virusmengen funktioniert, so muss die Virus-RNA unbeschädigt sein.

DNA und RNA wird normalerweise bei -80 Grad gelagert, da die alpha-Helix sehr schnell degradiert. Zeit spielt also eine wichtige Rolle in der Probenkonservierung. Das bedeutet: Die entnommene Probe muss schnellstmöglich an das Labor gesendet und untersucht werden.

Egal wie gut die PCR für den Nachweis von Sars-CoV-2 geeignet ist, wenn die ursprüngliche Probenentnahme, Probenverpackung und Probenversendung nicht korrekt oder zu langsam war, dann gibt ein PCR-Test gar kein oder schlimmstenfalls ein falsch negatives Ergebnis.

Natürlich ist das alles viel verlangt, wenn man berücksichtigt, wie stressig und arbeitsintensiv der Klinikalltag während einer Pandemie wirklich ist. Druck und Überarbeitung führen leider oft zu Hektik und Ungenauigkeiten. Deswegen sollten wir alles tun, um das gesamte Klinikpersonal und die Labormitarbeiter zu unterstützen. Mediziner können hierfür Ihre freien Kapazitäten eintragen, um z.B. Vertretungsdienste zu übernehmen.

Ausblick und Fazit

Wie in vielen anderen Lebensbereichen werden auch Experimente und Analysen in den Laboren immer mehr automatisiert. Obwohl die Wirtschaft im Moment leidet, ist wohl zu erwarten, dass Biotech Unternehmen, welche auf PCR-Techniken spezialisiert sind, durch die Covid Pandemie einen finanziellen Aufschwung erleben. Mit besseren PCR-Maschinen wird man im Zukunft noch schneller noch mehr Menschen testen können. Die aktuellen Vorreiter unter den PCR-Maschinen sind allerdings schon mehr als hochleistungsfähig und können 96 Test-Tupfer in 30 Minuten abarbeiten. Dennoch gibt es eine unvorhersehbare Komponente, auf die wir uns weder mit besseren Plänen noch Maschinen richtig vorbereiten können.

Wie fast alle Viren wird wohl auch Sars-CoV-2 mit der Zeit mutieren. Das passiert wahrscheinlich langsamer als bei der Influenza – bedeutet jedoch, dass der PCR-Test ständig verbessert und angepasst werden muss.

Wenn der Virus mutiert, müssen höchstwahrscheinlich neue Primer designet werden was eine kontinuierliche Typisierung des Virusgenoms voraussetzt.

Video: Harald Lesch zum Faktor: „Mutation des Covid-19-Virus“.(Start bei 1:25 min.)

Es ist also nicht zu erwarten, dass genau der gleiche PCR-Test für die nächsten Jahre verwendet werden kann. Das ist ähnlich wie bei der Grippeimpfung, welche jedes Jahr angepasst werden muss. Natürlich hängt all dies davon ab, wie stark der Virus tatsächlich mutiert und an welchen Stellen im Genom.

Wie so oft in der Wissenschaft und Forschung passt hier der Satz ‚wir wissen noch nicht genug und müssen abwarten’. Ich bin mir jedoch sicher, dass Kary Mullis sich das auch öfter gedacht hat. Und er hätte wohl nie erwartet, dass seine ‚Erfindung’, die PCR, einmal im Mittelpunkt einer weltweiten Pandemie steht und dabei hilft, Leben zu retten.

Carla Schmidt ist Molekularmedizinerin der University of Oxford
Carla Schmidt , Molekular-Medizinerin der Oxford University

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